아싸이베리 연구 논문-폴로리다대학의식품과학/인간 영양학부

Brazilian berry destroys cancer cells in lab, UF study shows 아싸이베리는 연구결과에 의하면 암세포를 파괴한다고 알려졌습니다.   아싸이베리 연구 논문 플로리다 대학의 식품과학/인간 영양학부   관련 URL  http://news.ufl.edu/2006/01/12/berries/ 에서 직접 확인하십시오.       아싸이 베리....   아사이 폴리페놀이 HL-60 인간 백혈병 세포 내 세포사멸 유도와 항증식에 미치는 효과가 조사되었다. 글리코사이드와 아글리톤 형태 내의 안토시아닌과 비안토시아닌폴리페놀 간 상호작용 역시 부가적, 혹은 비부가적 반응을 측정하기 위해 조사되었다. 0.17-10.7μM에서 폴리페놀 분획물이 caspase-3 활동(세포사멸)로 인하여 56-86%까지 세포증식을 감소시키는 것으로 나타났다. 안토시아닌과 폴리페놀 분획불은 세포 항증식 활동에의 분포에 있어서 비부가적이었다.   등분자 농도에서 페놀산과 후라보노이드의 글리코사이드형태는, 각각의 어글리콘 형태보다 세포파라미터(증식과 사멸) 내에서 더 높은 변화를 유도했다. 안토사이닌 어글리콘에서는 반대현상이 관찰되었다. 이 연구는 아사이가 대생물활성화 폴리페놀의 좋은 공급원이 될 수 있다는 것을 보여주었다. 또한 각각의 식물화학물질의 잠재적 건강효과를 측정하는 데 있어서 전체 음식 시스템 조사의 중요성을 입증시켜주었다.   소개 자연발생적 폴리페놀의 식이 섭취는 고지혈증, 심혈관질환, 암을 포함한 많은 만성 질병을 예방하는 데 도움을 준다고 알려져있다. 폴리페놀의 화학예방 효과는 그것의 항산화 활동에만 연결되어있는 것이 아니라, 암 억제(항증식, 돌연변이분자 활동, 효소억제, 해독 효소 유도 등)와 연관된 다른 생리학적 기능을 조절하는 능력과도 연관이 있다. 후라보노이드는 다양한 생물학적 프로세스(미토겐 신호나 DNA합성을 포함하는)를 억제하는 능력이 있어서 세포주기 억제를 유도하는 것으로 보인다.   많은 시험관 실험과 생체실험 시스템은 식물화학물질의 단일체나 단순복합체가 생물학적 시스템에 어떠한 영향을 미치는지 보여주었다. 그러나 폴리페놀 복합체의 상호작용하는 법과, 이것이 특정 과일이나 채소의 대생물활성 특성에 미치는 영향에 대한 연구는 상당히 적다. 게다가 자연발생 폴리페놀의 대사산물은 어글리콘(aglycones), sulfonated, gluconated, methylated 유도체 형성을 통한 대생물활동에 연관이 있는 것으로 보인다.   Euterpe oleracea Mart(아사이)는 최근 비교적 많은 양의 항산화 폴리페놀을 가지고 있다고 밝혀진 아마존 토종 야자열매이다. 그러나 그것의 대생물활성 특성은 아직 자세히 조사되지 않았다. 그래서 최근 연구는 아사이의 HL-60 사람 전골수구성백혈병 세포 내의 식물화학 분획물을 통하여 아사이 열매 과육의 항증식, 전세포사멸 활동을 측정하였다. 과육에 있는 식물화학물이 추출되었고, 이것은 C18컬럼에의 용해성과 친화력 특성에 근거하여 분획되어 각각의 분획물의 비교 대생물활성성이 측정되었다. 식물화학 분획물 간에 존재하는 상호작용들도 조사되었다.   또한 이 물질들은 이전 연구에서 보고되었다시피 생체 내에서 대생물활성화 활동을 보이므로, 이들의 자연발생적 형태에 비교한 항증식 활동 측정을 위하여 폴리페놀 분획물들은 산(acid)가수분해되어 어글리콘으로 변화시켰다. 생리학적 농도의 범위 내에서 항산화, 대생물활성화 특성이 측정되었고, 이것은 cyanidin 3-글리코사이드 대사에 근거한 것이었다. 주요 폴리페놀 합성물은 아사이에서 발견되었다. 이 연구는 아사이가 HL-60백혈병 암세포에 대하여 전(pro)세포사멸과 항증식활동을 가지는 대생물활성화폴리페놀의 풍부한 공급원이 된다는 결과를 보여주었다.   도구와 방법 1. 아사이 과육 속의 식물화학물질을 분획, 정제하기 위해 사용되는 단순 분획 도식 도구: 저온살균되어 얼린 아사이 과육이 Amazon Energy. LLC(Greeley, CO)로부터 제공되었고, 플로리다 대학의 식품과학/인간 영양학부에 밤새 운반되었다. 가용성과 친화성 특징에 근거하여 아사이 식물화학물질이 정제, 분획되었다. 아사이 식물화학물질을 분획하기 위해 이용된 분리 형식(scheme)은  다음과 같이 요약된다.   아세톤과 페트롤리움 에테르의 첨가에 의한 친수성 물질로부터 리포필릭(Lipophilic) 합성물이 분할되었다. 상위 페트롤리움에테르 단계가 제거되었고, 이것을 니트로겐의 완만한 흐름 속에서 농축하여 굳혔다. 그리고 분리물은 다시 디메틸 술폭시드(DMSO; Sigma, St. Louis, MO)의 용적 내에서 다시 녹여졌다. Hydrophilic 물질은 더 낮은 단계로부터 <40℃의 낮춰진 압력에서 아세톤을 제거함으로써 복구되었다.   수양액 단계에서 얻어진 폴리페놀은 이어 C18 Sep-Pak Vac 20 세제곱cm 미니컬럼(Waters Corporation, Milford, MA)을 이용하여 이온화된 물질로부터 분획되었다. 페놀산과 후라보노이드는 에틸아세테이트와 녹여져 분리된 후, 안토시아닌 제거를 위해 산성화(0.01%HCI) 메탄올 내에서 분리되었다. 각각의 분획물은 디메틸 술폭시드 농도 2mL/L에서 <40℃의 진공상태에서 증류되고, 디메틸 술폭시드(DMSO) 안에서 다시 녹여졌다. 폴리페놀 복구는 모든 분획물에서 >90%에서 이루어졌다. 아사이 전체 과육을 포함하여, 아사이 추출물에서 6개의 분획물(1:과육전체, 2:지방친화성 분획물, 3:C18결합 페놀과 안토시아닌, 4:에틸아세테이트 가용성 폴리페놀, 5:분리된 안토시아닌, 6:C18비보유 분획물)이 얻어졌다.   글리코사이드나 어글리콘 형태 내에서의 아사이 폴리페놀의 항산화, 항증식 특성을 비교하기 위하여 분획물3-5 합성물은 산(acid)가수분해되어, 50% v/v 메탄올에서, 90℃에서, 60분 동안 2N HCI와 함께 어글리콘으로 변형되었다. 산가수분해 뒤에 폴리페놀은 C18컬럼에서 분획되었고, 이 분획물은 DMSO 용적 내에서 다시 녹여져 가수분해된 C18 결합 페놀과 안토시아닌(7번분획물), 가수분해된 에틸아세테이트 가용성 폴리페놀(분획물11), 이 세개의 부가적 분획물을 만들어냈다.   세포 배양에 사용하기 위해 선택된 폴리페놀 수치는 cyanidin 3-글루코사이드가 풍부한 음식 섭취 후의 혈액에서 기대할 수 있는 수치로부터 선택되었다. 0-156 μg/Ldml 시아니딘(cyanidin) (혹은 0-10.7μM 의 총 가용성 페놀) 을 함유한 추출물들이 측정되고, 케르세틴 어글리콘(0-400μM)(Sigma, St. Louis, MO)의 추출물과 비교되었다. 비가수분해된 분획물과 가수분해된 분획물은 같은 농도의 폴리페놀과(and/or) 안토사이닌과 함께 테스트되었다.   세포와 세포배양 - 사람 전골수구성(promyelocytic)백혈병(HL-60)세포는, 10%의 fetal calf serum, 2μM의 L-glutamine, 100000 units/L의 페니실린, 0.1g/L의 스트렙토마이신, 0.25mg/L의 펀지존(fungizone), 0.05g/L의 겐타마이신이 들어있는 RPMI 1640 배지에 보존되었다. 세포들은 37℃, 5% CO2 습도의 환경에서 배양되었고, 45-60 패시지(단계) 사이에 이용되었으며, 신선한 배양배지(배양기)에서 세포가 부력에 의해 떠다니는 상태(입자에 부착하지 않고)로 2.5 - 10×105승의 cells/mL의 밀도로 보존되었다.    tryphan blue exclusion으로 측정된 세포 생존력은 ≥95%였다. 분석을 위하여 세포는 96-웰 조직 배양 미량역가판에서 1.33 × 10의7승의 농도로 부력에 의해 떠다니는 상태가 되었으며, 0에서 10.7μM의 아사이 분획물과 0에서 400μM의 케르세틴 분획물 각각으로부터의 가용성 페놀 농출물과 함께 처치되었다. 강력한 토포이소머라아제(topoisomerase-1)억제제인 캄토테친(Camptotechin)(Sigma, St. Louis, MO)은 세포사멸 유도를 위한 양성 제어제로서 사용되었다. DMSO(디메틸 술폭시드, dimethyl sulfoxide) 2mL/L를 포함하는 제어 배양이 모든 분석법에 포함되었다. Neubauer hemacytomer 내의 tryphan blue 염색을 통하여 세포수와 생존력이 측정되었다.   세포 생존능력 - 세포가 가용성 MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-yl]-2,5-디페닐 테트라졸리움 브롬화물: Sigma, St. Louis. MO)을 비가용성의 보라색 포마잔(formazan) 반응물질로 바꾸는 능력을 이용하여 미토콘드리아 기능에 근거한 세포 생존력이 분석되었다. 24시간동안 폴리페놀에 노출된 후 세포(1×10의6승 cells/mL)들은 빈 미량역가판으로 옮겨졌다.   그리고 5 mg/mL의 인산염으로 완충된 염류(PBS; 1:1) 내에서 무균필터링된 MTT 10μM가 각각의 웰(판)에 첨가되었다. 판은 그 후에 CO2 5%, 37℃의 배양기에 4시간 동안 보존되었다. 배양 뒤에 보라색 수정체를 녹이기 위해 100μM의 산(acid)2-프로판올(0.04 N HCI, 1:300)이 첨가되었다. 뒤이어 흡수정도가 UV-max 마이크로판 리더에 의해(490nm의 표준 파장) 540nm로 측정되었다. 데이터는 DMSO 제어에 대한 세포 사망률로서 표현되었고, 안토시아닌의 존재로 인한 배경 간섭 때문에 HL-60세포(사람 전골수구성(promyelocytic)백혈병세포)가 없는 빈 판을 이용한 보정이 이루어졌다.   카스파아제(Caspase)-3 활동 - 아사이 식물화학 분획물이나 순수 물질의 전새포사멸 활동이 카파아제-3 활동 측정을 통해 조사되었다. 이 분석에서 카파아제-3 활동은 기질(substrate, 효소의 작용으로 화학반응을 일으키는 물질)의 분할을 유도하였다. 이것은 p-nitroaniline(pNA)의 방출을 야기하였는데, 이것은 405nm에서 측정될 수 있었다.   처치된 HL-60 세포들은 2,3,4,5,6시간의 각기 다른 노출시간 후에 모아졌고, PBS에서 3중 세척된 후 1200rpm에서 10℃ 10분간 원심분리되었다. 세포들은 그 뒤 100μL의 세포 용해 완충용액(10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid[HEPES], 2mM ethlenediaminetetraacetic acid [EDTA], 0.1% Triton X-100, 1mM의 phenylmethylsulfonylfluoride, 10 μg/mL의 pepstatin A, 20μg/L 의 leupeptin, 10μg/mL의 aprotinin, 2mM의 dithiothreitol[DTT])에서 부력에 의해 떠다니는 상태로 보존되었다. 200μM의 DEVD-pNA 기질을 포함하는 50μL의 총 반응 완충용액(100 mM HEPES, 20% v/v glycerol, 0.5 mM EDTA, 5mM DTT)이 세포 융해체를 포함한 각각의 웰에 첨가되었고, 37℃에서 CO2 5%의 배양기에서 배양되었다. 방출된 pNA 수치는 기준파장 450 nm의 UV-max 마이크로플레이트 리더에서 405nm로 측정되었다. 데이터는 DMSO 제어에 대한 활성 카파아제-3 활동의 비율로 표현되었다.   식물 분석 - 아사이에 들어있는 안토시아닌 글리코사이드가 각각 Del Pozo-Insfran과 동료들의 실험에서 HPLC 조건에 따라 시아니딘(cyanidin) 규격(AS, Sandnes, Norway의 폴리페놀 실험실)을 이용하여 양이 측정되었다. 인증된 규격과 비교하여 안토시아닌 PDA 스펙스럼 해석에 근거하여 분석되었다. 주요 후라보노이드와 페놀 산은 Del Pozo-Insfran과 그 외의 사람들의 크로마토그래픽 조건을 이용해서 HPLC에 의해 아사이로부터 분리되었다. 폴리페놀은 분광분석과 정체시간, 입증된 규격과의 비교를 통하여 분석되었다. 폴리페놀 유도체 각각의 동량의 자유 형태(Free form)을 이용하여 폴리페놀 유도체 양이 측정되었다.   아사이 과육 추출물에서 얻어진, 안토시아닌과(and/or) 폴리페놀 아글리콘을 함유한 6개의 분리물(분획물1-6)과 3개의 가수분해된 분리물(분획물7-11)은 활성산소 흡수 수치 분석법을 통하여 항산화능력이 측정되었다. 각각의 분리물들은 pH7.0 인산염완충용액에서 적절히 희석된 후 96-웰 마이크로플레이트에서 (인산염 완충용액 추출 용매로 인한 배경 간섭 때문에 보정되었으며) 피페팅되었다. 각각의 가수분해, 혹은 비가수분해된 가용성 페놀 분획물 총량은 Folin-Ciocalteu분석법을 통해 갈산(gallic acid)과 등량으로 그 양이 측정되었다.   2. 비가수분해된, 그리고 가수분해된 아사이 분획물 식물화학물질의 가용성 페놀 성분 총량. 분획물 3-5에 나타난 폴리페놀 물질은 산가수분해되어 각각의 아글리콘으로 변화되었다.(각각의 분획물 7,11,8). 갈산 동량을 사용하여 총 가용성 페놀의 양이 측정되었다. 모든 분획물을 지나는 막대들(각각 다른 글자들과 함께있는) 사이에는 매우 큰 차이가 보인다.   결과와 쟁점 식물화학 성분 - 우리의 이전 식물화학성분 특성연구에 따르면 아사이의 유력한 폴리페놀성분은 다음을 포함한다. 시아니딘 3-글루코사이드, ferulic산, 에피카테친, p-hydroxy benzoic산 (각각 1, 120, 250, 112, 104 mg/L, 과육에서). (+)-Catechin, pelargonidin 3-글루코사이드, 갈산, protocatechuic, free ellagic acid도 ca. 60mg/L 상태에서 존재했다. vanillic, p-coumaric산은 더 낮은 농도(각각 32.7, 17.8mg/L)에서 발견되었다. 갈산, 엘라그산(ellagic acid)과 분광 특성을 공유하는 다른 폴리페놀 합성물도 발견되었고, 모두 갈로타닌(각각 32.7, 17.8mg의 갈산 동량/L)이나 엘라그산 글리코사이드(17.8mg의 엘라그산 동량/L)으로 각각 확인되었다.   단일 아사이열매 과육은 1173mg/L의 총 안토시아닌, 960mg/mL의 페놀산(phenolic acids)과 후라보노이드(HPLC에 의해 측정), 5660mg/L의 총 가용성 페놀(갈산 동량)을 함유하고 있었다. 세포배양실험을 위해 선택된 폴리페놀 수치는 시아니딘 3-글루코사이드(아사이 속에 들어있는 유력한 폴리페놀물질)와 함께 흡수력 실험에 근거한 것이다. 보고된 약물동력 파라미터에 따르면 최대 원형질 농도 45.4μg/L는 이 안토시아닌 580mg의 구강 투여 60분 후에 다다르게 된다.   그러므로 이러한 농도로 측정된 시아니딘 3-글루코사이드는 0-500mL의 완전한 아사이과육(0-567mg/L 안토시아닌)섭취 후의 사람 원형질 내에서 수치 0에서 50μg/L에 다다를 수 있다. 50에서 400μg/L의 시아니딘 농도 값 역시 측정되었다. 각기 다른 아사이 식물화학 분획물들의 대생물활동 특성은 시아니딘 3-글루코사이드와 가용성 페놀(전체 과육 속에 존재하는) 사이의 분자 관계를 따르는 총 가용성 페놀 수치(0-10.7μM)로서 보고되었다. 분획물들은 페놀산과 후라보노이드, (and/or) 안토시아닌 수치(HPLC로 측정) 동량으로 측정되었다.   아사이 식물화학 분획물의 항산화, 금속물질 감소 활동 가용성과 친화성의 특성에 근거한 아사이 식물화학물질 분획물은 항산화, 금속이온 감소 활동을 하는 성분의 분포 측정을 위하여 연구되었다. 결과물은 각각의 분획물의 총 가용성 페놀 성분과 항산화성분이 전체 과육의 활동에 비부가적인 기여를 하는 것으로 드러났다.   이것은 아마도 식물화학성분 사이에서 발생하는 물리/화학적 상호작용 때문인 것으로 보인다. 산가수분해는 각기 다른 조건에서 각각의 분획물의 가용성 페놀과 항산화 수치에 영향을 주었다. 등분자 농도에서 페놀산과 후라보노이드의 글리코사이드 형태는 세포 파라미터(증식과 사멸) 내의 더 높은 규모(각각의 아글리콘형태에서의 수치보다 더 높은)의 변화를 유도하였다.   비슷한 농도의 총 가용성 페놀과 항산화 능력이 비가수분해 안토시아닌함유 분획물 모두(분획물1,3,4,5)에서 관찰되었다. 나머지 분획물들은 상당히 낮은 수치를 보였다. 이 결과는 두 타입의 폴리페놀(C18 결합 폴리페놀 분획물인 분획물3)을 포함하는 분획물과 비교할 때, 비부가적 항산화, 금속물질 감소 능력에의 기여가 에틸아세테이트 가용성 페놀(분획물4)과 분리된 안토시아닌(분획물5)으로부터도 관찰되었다. 이 효과는 후자 분획물(분획물3)의 활성산소 제거, 금속물질 감소 능력에 가지는 효과가 각각의 분획물 4, 5의 총량이 가진 효과보다 낮다는 것을 시사한다. 각각의 안토시아닌과 폴리페놀 분획물은 분석을 위해 재결합되었고, 이들의 활동은 C18결합 폴리페놀의 활동과 다르지 않았다.   산가수분해는 비가수분해된 분획물5와 비교하여, 분리된 안토시아닌을 함유한 분획물7 내에서의 총 가용성 페놀과 항산화 능력 증가에 크게 기여했다. 그러나 산가수분해는 페놀산과 후라보노이드를 포함한 분획물 7과 11의 수치는 감소시켰다. 분획물 3과 7 사이에서 항산화 능력과 총 가용성 페놀의 양은 분획물 4와 11 사이에서 각각 56, 96%였던 것에 비교하여 7, 27% 각각 감소했다. 이러한 결과는 아사이 비안토시아닌 폴리페놀 글리코사이드형태가 가수분해 시에 파괴되었거나, 혹은 결과물 아글리콘이 활성산소 제거나 금속물질 감소 능력에 있어 효과가 낮다는 것을 보여준다.   이러한 효과는 Anselmi와 그 동료들, Garcia-Conesa와 동료들에 의해서도 관찰되었다. 결과는 같은 그램분자비율에서 활성 페룰린산(free ferulic acid)형태는 이것의 디하이드로 이합체 형태일 때보다 높은 <50%의 항산화 수치를 보였다. 아글리콘 형태 간의 상호작용은 이들의 글리코사이드 형태일 때와 비교하여 더 증가할 수도 있다. 다른 연구들 역시 각각의 폴리페놀간 대립적 상호작용을 보여주었고, 음식 속에 존재하는 항산화 풀리페놀의 다양성은 세분화된 측정값을 매기기 어려운 복합모체를 생산할 수 있다는 것을 보여준다. 게다가 항산화물질의 효력은 테스트 시스템의 극성(polarity)과 래디칼의 성질, 항산화물질로부터 보호받는 기질(substrate)의 타입에 달려있다.   아사이 식물화학 분획물의 항증식 효과 아사이 전체 과육의 항증식, 전세포사멸활동은 HL-60세포를 이용한 세포배양 모델 내에서 측정되었고, 아사이의 각각의 식물화학 분획물과 비교되어, 이 분획물들이 어떻게 전체 과육의 대생물활성 특성에 기여하는지에 대해 조사되었다. 관찰된 세포증식억제 활동은 케르세틴 아글리콘(여러 암세포계 내에서 강력한 항증시기 활동을 하는 폴리페놀 합성물)과 비교 연구되었다.   HL-60 세포가 아사이 식물화학 분획물에 24시간 동안 노출되었을 때 세포 생존력의 복용의존적 감소가 모든 분획물에서 관찰되었다.(지방친화성을 띤 분획물2와 C18비보유 분획물6을 제외) 이들은 농도에 독립적으로 세포 생존력을 <5%까지 감소시켰다. 비가수분해된, 안토시아닌함유 분획물인 분획물 1,3,5는 HL-60세포의 증식을 강력히 억제하였다.(복용의존상태에서 세포사멸을 유도하며) 안토시아닌이 풍부한 추출물에 의한 HL-60세포 성장의 강력한 억제효과는 이전의 조사에서도 관찰되었따.   Chang과 그 동료들은 3mg/mL의 안토시아닌이 풍부한 추출물(히비스커스 꽃-4%의 delphinidin 3-글루코사이드, 에서 분리된)에 24시간 노출된 세포 생존력이 75% 감소하는 것을 발견했다. Fimognari와 동료들은 0.2mg/L의 시아니딘 3-글루코사이드 첨가가 HL-60 세포의 생존능력을 37%감소시켰다고 보고했다.   항산화 능력과 총 가용성 페놀에 대한 관찰과 비슷하게, 에틸아세테이트 가용성 페놀(분획물4)와 안토시아닌(분획물5)는 이들의 C18결합 페놀(분획물3)과 전체과육(분획물1)분획물의 세포 항증식 활동에 대한 기여에 있어서 비부가적이었다. 이러한 결과는 아사이 식물화학물질 간의 대립적 상호작용이 이들의 항증식 특성에 불리한 영향을 미친다는 것을 시사한다. Katsube와 동료들은 여러가지 딸기 추출물의 안토시아닌 구조는 비슷하지만, 이들의 항증식 활동은 매우 다르다고 말했다.   이들은 각각의 추출물의 대생물활동 특성은 각각의 식물화학물질 형태와 농도, 열매 구성요소간의 상호작용, 음식 모체의 특성에 따라 달라진다고 말한다. 다른 연구들 역시 중요한 대립, 상조작용이나 부가적 효과들은 각각의 폴리페놀 복합체들이 생물학적 시스템 내에 함께 존재할 때 일어난다고 말한다.(이 복합체는 물론 단일한 물질이 아니라 전체 열매와 채소 내의 갖가지 다른 식물화학물질을 말한다) 그리고 이것이 역학실험과 임상실험 결과로 보고된 건강 효과에 연관되어 있다는 것이다.   3. 각각 다른 비가수분해된, 그리고 가수분해된 아사이 식물화학 분획물들에 의해 유도된 HL-60 세포 사멸, 전체 과육의 가용성 페놀 농도 0-10.7μM에 24시간 노출. 분획물 3-11은 동량의 폴리페놀과(and/or) 안토시아닌 물질(HPLC로 측정된)으로 실험되었다. 두번의 반복실험의 각각의 값은 mean ± SE (각각 n=3). 세포 생존력 측정은 제어 치료(DMSO 2mL/L 포함)의 미토콘드리아 기능에 근거하여 이루어졌다.   테스트된 분획물들은 전체 과육(분획물1), 지방친화성 분획물2, C18결합 페놀, 안토시아닌인 분획물3, 에틸아세테이트 가용성 폴리페놀인 분획물4, 안토시아닌인 분획물5, C18비보유 분획물6, 가수분해된 C18결합 페놀, 안토시아닌인 분획물7, 가수분해된 안토시아닌인 분획물8, 가수분해된 에틸아세테이트 가용성 폴리페놀인 분획물 11이었다.   동량의 폴리페놀과 안토시아닌 농도에서 에틸아세테이트 가용성 페놀(분획물 1,5)를 함유한 분획물은 다른 분획물(안토시아닌을 포함한 분획물3과 5)보다 더 낮은 세포사망율을 보였다. 분획물 3과 5는 10.7μM에서 세포 생존력을 17% 감소시켰고, 동량 식물화학 농도에서 분획물 1과 4는 세포증식을 38% 감소시켰다.   (1.35μM농도에서 테스트되었을 때의 분획물 1,4의 성장억제와 비교할 때,) 가장 낮은 농도(0.17μM)에서 측정되었을 때 분획물 3, 5는 세포 생존력을 50%까지 감소시켰다(IC50 수치). ~200μM농도의 케르세틴과 0.31μM의 캄토테친 역시 HL-60세포의 수를 50%까지 감소시켰다. 400μM 농도의 노출에서는 66%의 성장 억제가 나타났던 것에 반해 50≤ μM농도의 케르세틴에서만 근소한 성장억제가 보였다. 후자는 10.7μM 농도에서 분획물 1,4가 보인 수치와 비슷하다.  산가수분해는 각각의 분획물(테스트된 분획물 각각의 다른 상태에서)의 항증식 활동에 영향을 주었다.   4. 아사이 C18결합 페놀(분획물3)(글리코사이드형태와 아글리콘형태 각각)에의 각각 다른 노출시간(2-4시간)으로 노출된 HL-60세포 내의 카파아제-3 활동. C18결합 페놀 분획물은 폴리페놀과 안토시아닌 성분(HPLC로 측정된) 동량에서 테스트되었다.   2mL/L의 DMSO를 포함한 제어 처치에 비교되는 카파아제-3 활동 배(fold)증가. 각각의 수치는 두번의 반복실험에서 mean ± SE (각각 n=3) 비가수분해된 C18결합 페놀 분획물(분획물4)은, 농도 ≥1.35μM일때 중요 세포 파라미터(증식과 사멸)에서 아글리콘 형태(분획물11)일 때보다 더 높은 규모의 변화를 유도하였다.   그러나 항산화와 금속물질 감소 능력에서는 두드러진 차이가 관찰되지 않았다. 안토시아닌 글릴코사이드(분획물8)의 산가수분해는 그들의 항증식 효과를 조금 증가시켰다(<9%). 그리고 가수분해는 페놀산과 후라보노이드(분획물11)의 세포분열억제 효과를 크게 감소시켰다. 농도 0.68μM에서 안토시아닌 아글리콘(분획물8)은 훨씬 낮은 농도(4배)에서 전체 과육 분획물(분획물1)과 비슷한 항증식 효과를 보였다. 가수분해된 안토시아닌함유 분획물 모두에서 IC50 수치는 0.17μM이었고, 분리된 페놀(분획물11)은 더 높은 농도(5.4μM)에서 비슷한 효과를 나타냈다.   아사이 식물화학물질의 전세포사멸(pro-apoptotic) 효과 - 아사이 식물화학물질에 의한 HL-60세포의 항증식 효과가 카스파아제-3의 활동과 관련이 있는지 측정하기 위해 아사이 식물화학 분획물 각각의 전세포사멸 활동을 측정하였다. 아사이 식물화학물질로 인한 전세포사멸 반응이 달라지는 것이 이들의 성분이나 형태(글리코사이드형태냐 아글리콘형태냐에 따라)에 따른 것인가를 알아보기 위해 카파아제-3 활동의 시간 코스 반응 역시 측정하였다.   아사이에 존재하는 식물화학물질은 카파아제-3의 활성화(복용, 시간의존적상태에서)를 유도하는 것으로 나타났다. 카파아제 활도오 최대치는 비가수분해 안토시아닌 함유 분획물(분획물3,5)의 식물화합물에 3시간 노출된 후에 도달하였다. 페놀산과 후라보노이드 분획물(분획물4)을 포함한 분획물에는 4시간 노출 후 최대 활동치에 도달하였다. 카파아제-3 활성은 모든 테스트된 분획물에서 4시간에서 6시간 후에는 큰 변화를 보이지 않았다.   5. 글리코사이드형태, 아글리콘형태 각각의 형태의 아사이 안토시아닌(분획물5)에 각각 다른 시간(2-4시간)동안 노출된 후의 HL-60세포 내 카파아제-3 활동. 안토시아닌 분획물은 동량의 안토시아닌물질(HPLC로 측정된)로 테스트되었다. 카파아제-3 활동의 배수증가(fold-increase)는 DMSO 2mL/L값의 제어처치와 비교되었다. 두번의 반복실험에서 각각의 값은 mean ± SE (각각 n=3)였다.   6. 글리코사이드, 아글리콘 각각의 형태의 아사이 에틸아세테이트 가용성 페놀에 각각 다른 시간(2-4시간)동안 노출된 후의 HL-60세포 내 카파아제-3 활동. 폴리페놀 분획물은 동량의 폴리페놀물질(HPLC로 측정된)에서 테스트되었다. 카파아제-3활동의 배수증가는 DMSO 2mL/L를 포함하는 제어처치에 비교되었다. 각각의 값은 두번의 반복실험에서 mean ± SE 였다. (n=3)   결과는 더 낮은 페놀 농도(0.17-2.7μM)에서 더 큰 비율의 카파아제-3 활성화를 보여주었다. 카파아제-3의 증가된 활동은 모든 분획물의 세포 생존력에 반비례 연관성을 가진다. 일반적으로 각각의 아사이 분획물(캄토테친과 케르세틴 포함)에서 카파아제-3 활동이 5배 증가하면 50%의 세포 사멸이 일어났다.   7. 케르세틴(농도 0-400μM), 캄토테친(0-10.7μM)에 각각 다른 시간(2-4시간)동안 노출된 HL-60세포 내 카파아제-3 활동. 카파아제-3 활동의 배수증가는 DMSO 2mL/L를 함유한 제어처치에 비교되었다. 두번의 반복실험에서 각각의 수치는 mean±SE (각각 n=3)   안토시아닌 함유 분획물(분획물1,3,5)을 이용하여 관찰된 세포성장억제 최대치는 카파아제-3 내의 8.2배 증가와 연관되어 있었는데, 이것은 캄토테친 2.5μM일 때의 항증식효과와 비슷했다. 이 결과는 아사이 식물화학물질이 유도한 세포하멸이 카파아제-3 조절 메카니즘에 연관된다는 사실을 보여준다. 그러나 어떻게 카파아제-3이 그것들로 인해 활성화되는지는 아직 의문이다.   Chang과 동료들은 히비스커스의 안토시아닌이 풍부한 추출물로 인해 유도된 세포사멸이 p38, c-Jun키나아제의 활성화를 거치며, 카파아제-8은 카파아제-3의 활성화를 유도한다고 말한다. Fimognari와 동료들은 0.2μg/mL 농도(5.4μM의 아사이 가용성 페놀에 상응하는 시아니딘수치)의 3-글루코사이드 시아니딘에 30시간 노출되었을 때 분획물의 세포사멸이 36% 증가하고, 세포사멸 유도가 기능적 p53경로를 필요로하지 않는다는 것을 알아냈다.   상응하는 글리코사이드 형태와 비교해서 아글리콘형태는 카파아제-3 활동의 느린 개시를 보여준다. 그러나 가수분해된 분획물은 이들의 글리코사이드 형태(식물화학물질에 4시간 노출된 후)와 같이, 비슷한 카파아제-3활동을 유도하였다. 결과는 낮은 항산화, 금속물질 감소(분획물 7 ,11)능력을 가진 폴리페놀물질의 특성이 강한 세포분열억제 특성을 발휘할 수 있으며 세포사멸을 유도한다는 것을 보여준다. 이 효과는 Tokalov와 그 동료들에 의해서도 관찰되었다. 이들은 특정 식물화학물질의 구조와 농도가 어떤 세포주기 단계가 선택적으로 특정 암세포 타입에 영향을 주는지 결정한다고 말한다.   이들은 Parafavella denticulata에서 추출된 후라보노이드가 농도 ≤20μM에서 HL-60세포의 G2/M 단계에서 중지를 유도(S단계에서는 더 높은 농도, 더 큰 세포 분획물 존재함)한다고 밝혔다. 아글리콘이 이들의 글리코사이드 형태가 일으키는 활동과 같은 규모의 카파아제-3 활동을 유도하기 위해서는 더 긴 시간이 요구되었다. (이 합성물들은 특정 세포내 신호전달 변환경로와 각각 다르게 반응하고, 서로를 안정시킴으로써 이들의 안정성이 향상되고, 신호전달경로는 더 긴 시간동안 자극될 수 있다)   최근 연구는 아사이에 존재하는 폴리페놀이 카파아제-3 활성화(복용, 시간 의존조건에서)를 통하여 HL-60 백혈병세포 증식을 억제한다는 결과가 도출되었다. 또한 아사이 식물화학물질 사이의 대립적 상호관계는 이들의 전세포사멸과 항증식 특성에 역영향을 미친다는 결과도 나왔다. 그러므로 이 결과는 이 합성물들의 잠재적 건강 효과를 측정할 때에 실제적인 음식 시스템을 조사하는 것이 중요하다는 사실을 재확인시켜 주었다.  출처 관련 URL  http://news.ufl.edu/2006/01/12/berries/ 에서 직접 확인하십시오.